I molekylærbiologi kan godt buffervalg og forberedelse til forskellige DNA-isoleringstrin være forskellen mellem at gå videre til proteinekspression eller åbne et andet maxi-prep kit til at starte over. På trods af deres afgørende betydning er bufferopskrifter ofte bare det-opskrifter skrevet uden forklaring eller begrundelse for de forskellige komponenter. En sådan buffer er glucose-tris-EDTA eller GTE-buffer.
$config[code] not foundHvad bruges GTE til?
GTE anvendes til resuspendering af bakteriecellepellets forud for lysering (brydning) af cellerne og høstning af plasmid-DNA'et inde. Lysozym, der blødgør cellemembraner, tilsættes ofte sammen med GTE-bufferen. At opnå en homogen suspension af hele celler under dette trin, således at den efterfølgende tilsatte lysopløsning kan komme til alle cellerne er nøglen til at opnå gode DNA-udbytter. GTE er designet til at gøre dette samtidig med at der skabes et stabilt miljø for DNA'et.
Glucose til osmolaritet
50mM (millimolær) glucosesukker tilsættes til GTE-puffer for at opretholde osmolaritet, hvor den opløste koncentration uden for cellerne er tæt på den inde i cellerne. Dette forhindrer for tidlig cellelys, hvilket kan forårsage lavere DNA-udbytter på grund af aggregering og nedbrydning. De øvrige komponenter i bufferen bidrager også til opløsningens osmolaritet, men glucose, der er en ikke-elektrolyt, er et godt valg, fordi det ikke forstyrrer opløsningens bufferegenskaber.
Tris for pH-stabilitet
Tris er det korte navn for tris (hydroxymethyl) aminomethan, som er en meget almindelig pH-buffer. I tilfælde af GTE-buffer tilsættes surt salt (Tris-HCI) til bufferen i en koncentration på 25 mM. Dette opretholder opløsningens pH ved en nær fysiologisk 8,0, en ideel pH til forebyggelse af sur hydrolyse (nedbrydning) af plasmid-DNA'et og uønskede sidereaktioner af de andre cellekomponenter.
EDTA forhindrer DNA-nedbrydning
EDTA eller ethylendiamintetraeddikesyre, fanger eller "chelater" metalioner ud af opløsningen, hvilket forhindrer dem i at deltage i uønskede bivirkninger. I GTE-buffer tilsættes EDTA ved 10 mM. Dens primære formål er i bufferen at afrunde fri zink, magnesium og calcium og derved forhindre DNA-nedbrydning ved visse veje, der kræver disse metaller.
Nogle vigtige tips
Hold din GTE-buffer kold og lav den i små mængder for at forhindre væksten af utilsigtede bakterier i den. Sukker og den kontrollerede pH giver et godt vækstmedium. Brug altid renset vand. Kranvand kan have overskydende metalioner fra rørene, hvilket kan overvinde EDTA's evne til at opfange. Hvis du har mistanke om forekomsten af interfererende RNA i din prøve, skal du tilføje RNase A ved 100 mikrogram pr. Milliliter til din GTE-buffer for at eliminere problemet.
